Bicara tentang analisa kimia, salah satu hal yang sedikit merepotkan bagi saya adalah buffer. Buffer atau larutan penyangga adalah larutan yang terdiri dari asam lemah dan garam-nya yang dapat mempertahankan dan menjaga pH. Bidang bioteknologi tidak bisa dipisahkan dari penggunaan larutan ini.
Kebutuhan buffer kadang menyulitkan karena hampir setiap analisa membutuhkan kondisi pH tertentu yang relatif stabil. Karena banyaknya macam dan jenis buffer, pemilihan buffer yang akan digunakan menjadi masalah tersendiri.
Dalam memilih buffer, yang harus diperhatikan adalah pH optimum serta sifat-sifat biologisnya. Banyak jenis buffer yang mempunyai impact terhadap sistem biologis, aktivitas enzim, substrate, atau kofaktor.
Sebagai contoh buffer phosphat akan menghambat aktivitas dari beberapa metabolik enzim termasuk karboksilase, fumarase, dan phosphoglucomutase. Barbiturate menghambat phophorilasi oksidatif. Tris buffer bereaksi dengan amin primer dan memodifikasi transport elektron dan phosphorilasi pada kloroplast. Tris juga menghambat enzim respirasi di mitokondria. Dan masih banyak efek lain yang diberikan buffer. Oleh karena itu pemilihan buffer terkadang menjadi kesulitan yang cukup merepotkan. Oleh karena itu, gunakan konsentrasi buffer serendah mungkin yang masih dapat untuk memaintain pH.
Berikut beberapa macam buffer yang kerap digunakan:
A. GLYCINE–HCL; PH 2.2–3.6, PKA = 2.35
Campur 25 ml 0.2 M glycine dan x ml HCl, kemudian encerkan hingga 100 ml dengan air suling.
x (ml) | pH |
22.0 | 2.2 |
16.2 | 2.4 |
12.1 | 2.6 |
8.4 | 2.8 |
5.7 | 3.0 |
4.1 | 3.2 |
3.2 | 3.4 |
2.5 | 3.6 |
B. SODIUM ACETATE; PH 3.6–5.6, PKA = 4.76
Mencampurkan 0.1N acetic acid dan 0.1N sodium acetate untuk mencapai pH tertentu.
acetic acid (ml) | sodium acetate (ml) | pH |
185 | 15 | 3.6 |
176 | 24 | 3.8 |
164 | 36 | 4.0 |
147 | 53 | 4.2 |
126 | 74 | 4.4 |
102 | 98 | 4.6 |
80 | 120 | 4.8 |
59 | 141 | 5.0 |
42 | 158 | 5.2 |
29 | 171 | 5.4 |
19 | 181 | 5.6 |
C. BUFFERED SALINE (PBS, TBS, TNT, PBT)
Larutan buffer saline sering digunakan ketika melakukan eksperiment yang berhubungan dengan immunolocalization. Ada beberapa variasi dari buffer ini, tiga diantaranya sebagai berikut.
PBS 20x stock | TBS | ||
Potassium chloride | 4 g | 53.6 mM | Potassium chloride 4 g |
NaCl | 160 g | 274 mM | NaCl 160 g |
Potassium phosphate monobasic | 4 g | 29.4 mM | Tris buffer (10 mM, pH 7.5) to 1 liter |
Sodium phosphate dibasic (7•H2O) DI | 43.2 g | 17.5 mM to 1 liter | Use TBS when performing immunocytochemical |
experiments on phosphate-sensitive tissues | |||
(photosynthetic tissues typically) | |||
TNT | PBT | ||
NaCl | 150 mM | PBS to vol | |
Tris buffer (100 mM, pH 7.5) | to 1 liter | Tween 20 1% (v/v) |
D. CACODYLATE BUFFER; PH 5.0–7.4, PKA = 6.27
Sodium cacodylate buffer [Na(CH3)2 AsO2 • 3H2O] adalah alternatif dari Sørensen’s phosphate buffer. Mempunyai kapasitas buffer yang baik pada range pH 5.0–7.4. Cacodylate digunakan untuk aplikasi mikroskop elektron sebagai metode untuk menghindari penambahan phosphate saat sample preparasi. Mitochondria dan arganela lainnya dapat rusak jika terkena konsentrasi phosphate berlebih yang terdapat dalam Sørensen’s buffers.
Siapkan 0.2 M sodium cacodylate stock solution dalam air (4.28 g/100 ml). Tambahkan x ml 0.2 N HCL per 100 ml cacodylate stock solution, diikuti denga penambahan air demin sampai volume 400 ml hingga diperoleh 0.05 M cacodylate buffer pada pH yang diinginkan.
0.2 M HCl | pH |
94.0 | 5.0 |
90.0 | 5.2 |
86.0 | 5.4 |
78.4 | 5.6 |
69.6 | 5.8 |
59.2 | 6.0 |
47.6 | 6.2 |
36.6 | 6.4 |
26.6 | 6.6 |
18.6 | 6.8 |
12.6 | 7.0 |
8.4 | 7.2 |
5.4 | 7.4 |
E. CITRATE BUFFER; PH 3.0–6.2, PKA = 6.40
Citrate buffer stock solutions: A: 0.1 M citric acid; B: 0.1 M sodium citrate. Campurkan kedua larutan dengan perbandingan volume dan encerkan dengan air sampai 100 ml untuk membuat pH yang diinginkan.
0.1 M citric acid | 0.1 M sodium citrate | pH |
46.5 | 3.5 | 3.0 |
43.7 | 6.3 | 3.2 |
40.0 | 10.0 | 3.4 |
37.0 | 13.0 | 3.6 |
35.0 | 15.0 | 3.8 |
33.0 | 17.0 | 4.0 |
31.5 | 18.5 | 4.2 |
28.0 | 22.0 | 4.4 |
25.5 | 24.5 | 4.6 |
23.0 | 27.0 | 4.8 |
20.5 | 29.5 | 5.0 |
18.0 | 32.0 | 5.2 |
16.0 | 34.0 | 5.4 |
13.7 | 36.3 | 5.6 |
11.8 | 38.2 | 5.8 |
9.5 | 41.5 | 6.0 |
7.2 | 42.8 | 6.2 |
F. SØRENSEN’S PHOSPHATE BUFFER; PH 5.8–8.0, PKA = 7.20
Campur sejumlah tertentu stock solution dan tambahkan air suling untuk mendapatkan 100 ml larutan Sørensen’s phosphate buffer 0.1 M. Ingat, konsentrasi phosphate yang tinnggi dapat bersifat toksik bagi sel tanaman.
Stock solutions:
A 0.2 M NaH2PO4
B 0.2 M Na2HPO4
B 0.2 M Na2HPO4
A (ml) | B (ml) | pH |
92.0 | 8.0 | 5.8 |
87.7 | 12.3 | 6.0 |
81.5 | 18.5 | 6.2 |
68.5 | 31.5 | 6.5 |
62.5 | 37.5 | 6.6 |
56.5 | 43.5 | 6.7 |
51.0 | 49.0 | 6.8 |
45.0 | 55.0 | 6.9 |
39.0 | 61.0 | 7.0 |
33.0 | 67.0 | 7.1 |
28.0 | 72.0 | 7.2 |
23.0 | 77.0 | 7.3 |
19.0 | 81.0 | 7.4 |
16.0 | 84.0 | 7.5 |
8.5 | 91.5 | 7.8 |
5.3 | 94.7 | 8.0 |
G. PHOSPHATE–CITRATE BUFFER; PH 2.2–8.0, PKA = 7.20/6.40
Untuk membuat 100 ml larutan buffer phosphat-citrate.
Stock solutions:
0.2 M dibasic sodium phosphate
0.1 M citric acid
0.1 M citric acid
0.2 M Na2HPO4 (ml) | 0.1 M citrate (ml) | pH |
5.4 | 44.6 | 2.6 |
7.8 | 42.2 | 2.8 |
10.2 | 39.8 | 3.0 |
12.3 | 37.7 | 3.2 |
14.1 | 35.9 | 3.4 |
16.1 | 33.9 | 3.6 |
17.7 | 32.3 | 3.8 |
19.3 | 30.7 | 4.0 |
20.6 | 29.4 | 4.2 |
22.2 | 27.8 | 4.4 |
23.3 | 26.7 | 4.6 |
24.8 | 25.2 | 4.8 |
25.7 | 24.3 | 5.0 |
26.7 | 23.3 | 5.2 |
27.8 | 22.2 | 5.4 |
29.0 | 21.0 | 5.6 |
30.3 | 19.7 | 5.8 |
32.1 | 17.9 | 6.0 |
33.1 | 16.9 | 6.2 |
34.6 | 15.4 | 6.4 |
36.4 | 13.6 | 6.6 |
40.9 | 9.1 | 6.8 |
43.6 | 6.5 | 7.0 |
H. BARBITAL BUFFER; PH 6.8–9.2, PKA = 7.98
Untuk membuat 200 ml larutan buffer. Kedalam 50 ml Sodium barbital 0.2 M, tambahkan x ml 0.2 M HCl. Tambahkan air suling hingga volume 200 ml.
0.2 M HCl (x ml) | pH |
1.5 | 9.2 |
2.5 | 9.0 |
4.0 | 8.8 |
6.0 | 8.6 |
9.0 | 8.4 |
12.7 | 8.2 |
17.5 | 8.0 |
22.5 | 7.8 |
27.5 | 7.6 |
32.5 | 7.4 |
39.0 | 7.2 |
43.0 | 7.0 |
45.0 | 6.8 |
I. TRIS BUFFERS
Solution | Preparation | |
Tris, 1 M stock | Tris base DI Dissolve and adjust pH with the following approximate amount of HCl: pH 7.4 pH 7.6 pH 8.0 | 121.1 g 800 ml; 70 ml, 60 ml, 42 ml |
EDTA, 0.5 M | Disodium ethylene diamine tetraacetate Adjust pH to approx. 8.0 and stir until dissolved | 186.1 g |
SSC, 20x | NaCl NaCitrate DI Adjust pH to 7.0 with NaOH then add DI to 1 liter | 175.3 g 88.2 g 800 ml |
SSPE, 20x | NaCl NaH2PO4 • H2O EDTA DI Adjust pH to 7.4 with NaOH then add DI to 1 liter | 174 g 27.6 g 7.4 g 800 ml |
TE | Tris EDTA Adjust pH using Tris stock solution | 10 mM 1 mM |
STE (TNE) | Tris NaCl EDTA Adjust pH to 8.0 using Tris stock solution | 10 mM 100 mM 1 mM |
Stock solutions:
0.2 M glycine
0.2 M NaOH
0.2 M NaOH
Campur 25 ml glycine stock solution dengan x ml 0.2 M NaOH dan encerkan dengan air suling hingga volume 100 ml.
x ml 0.2 M NaOH | pH |
2.0 | 8.6 |
3.0 | 8.8 |
4.4 | 9.0 |
6.0 | 9.2 |
8.4 | 9.4 |
11.2 | 9.6 |
13.6 | 9.8 |
19.3 | 10.4 |
22.75 | 10.6 |
Demikian beberapa buffer yang bisa dijadikan pilihan untuk digunakan. Perlu diingat, bahwa larutan buffer hanya berfungsi untuk mempertahankan pH. Tidak berarti bahwa pH tidak akan berubah. Perubahan dan gangguan yang cukup besar dalam sistem dapat merubah pH meskipun telah ditambahkan buffer ke dalamnya.
Hal ini karena buffer hanya menjaga agar pH tidak terlalu berubah signifikan dengan adanya sedikit perubahan konsentrasi ion hidrogen dalam sistem.
oleh:
Tidak ada komentar:
Posting Komentar